BIOMOLÈCULES

Hi ha 4 grans tipus: Proteïnes, glúcids, lípids i àcids nucleics.

Estan formades per components més petits que s´uneixen entre ells i donen lloc a aquestes macromolècules. Aquests components són més bàsics i elementals.

Els àcids nucleics es formen per combinació de quatre nucleòtids.

Les proteïnes només estan formades per 20 aminoàcids diferents.

PROTEÏNES

Els gens sense proteïnes no serien res. Les proteïnes estan formades per una seqüència definida i fixa d´aminoàcids. Les proteïnes tenen una estructura molt ben definida. La primera proteïna en seqüenciar-se va ser la insulina. La va seqüenciar Frederick Senger.

AMINOÀCIDS

Els aminoàcids que es troben a les proteïnes són a-aminoàcids i tenen com estructura general:

Tenen el grup amino i àcid unit al Carboni a. Els diferents aminoàcids es distingeixen al radical R. Els aminoàcids tenen com a característica molt important que són asimètrics. Hi ha isomeria i hi ha isòmers òptics. Poden ser L-aminoàcids o
D-aminoàcids. Un L-aminoàcid és el que té el grup amino a l´esquerra i el D-aminoàcid el té a la dreta. Són representats de forma plana, però són tetraedres amb representació a l´espai.

Gairebé tots els aminoàcids naturals són de la sèrie L. Alguns pèptids d´alguns bacteris són de la sèrie D, però són poc freqüents. No significa que siguin levògirs o dextrògirs. L´únic aminoàcid que no té isòmers és quan R=H (Glycina), que no és asimètric.

Els aminoàcids tenen com a mínim dos grups ionitzables i depenen del grup R per tenir 3. En medi àcid (molts protons), tots els grups ionitzables estarien protonats. Es donaria a Phs baixos.

Quan pugem el Ph, un dels 2 grups perdrà el protó i serà en la forma desprotonada.

Els aminoàcids són molècules amfòteres (poden actuar com àcids o bases segons el Ph). També són zwitterions (ions dobles) perquè poden ser ions o cations.

Aquesta dissociació ve definida pel Pk. El Pk és el Ph en el qual el 50% de les seves molècules estan protonades i el 50% estan desprotonades.

El Pk del grup a-carboxil és aproximadament 2 i és semblant a tots els aminoàcids. El Pk dek grup a-amil és entre 9 i 10 i és molt bàsic.

Els aminoàcids són molt bons reguladors del PH (actuen com a tampons).

El punt en el que el Ph és més lent coincideix amb el Pk_a1. El Pk és la zona del Ph en que la capacitat tamponant d´aquest aminoàcid és màxima.

El punt isoelèctric és el Ph en el qual la càrrega elèctrica d´aquell aminoàcid és 0. És la suma dels 2 Pk_a. També funciona per a les proteïnes.

Per calcular el punt isoelèctric es calcula la semisuma dels Pk de les reaccions de dissociacions que donin una càrrega igual a 0.

Els aminoàcids es divideixen en 4 grups per formar les proteïnes:

1. Aminoàcids no polars: Alanina (Ala), Valina (Val), Leucina (Leu), Isoleucina (Ile), Prolina (Pro), Metinina (Met), Fenilalanina (Phe), Triptòfan (Trp). Els aminoàcids ALA, VAL, LEU, ILE són aminoàcids alifàtics (només tenen Carboni i Hidrògen i són hidrofòbics). La PRO és un iminoàcid. EL grup
a-amil està formant un cicle i no és lliure. El grup -NH₂- amb 2 enllaços és el grup imino. Tots els aminoàcids es tenyeixen en blau amb ninhidrina, excepte la Prolina, que és marró. Els aminoàcids s´uneixen a una cadena linial que es plega d´una determinada manera formant una estructura tridimensional. Es pot plegar la cadena peptídica perquè els enllaços senzills tenen rotació lliure. El grup imí no té possibilitat de rotació lliure. La Prolina és un punt on la cadena fa un gir i es trenca l´estructura tridimensional. La Prolina determina que es plegui d´una determinada manera la cadena peptídica. La Metinina té sofre. La Fenilalanina té un anell aromàtic de benzè. El Triptòfan té un anell doble de Ingold. Tant la Fenilalanina com el Triptòfan són grans i voluminosos.

2. Aminoàcids polars sense càrrega: Glycina (Gly), Serina (Ser), Threonina (Thr), Cysteïna (Cys), Tyroxina (Tyr), Asparragina (Asn), Glutanil (Gln). La Glycina és molt petita i és molt important per mantenir la tridimensionalitat perquè quan s´ha d´arreplegar molt estretament es troba, ja que ocupa molt poc espai i té poques interaccions hidrostàtiques. La Serina i la Threonina tenen un grup alcohol. La Cysteïna té un grup -SH. La Tyroxina és aromàtica i derivada de la Fenilalanina, però amb un grup hidroxil. El Glutanil i l´Asparragina tenen un grup amida.

3. Aminoàcids polars amb càrrega negativa, també es diuen aminoàcids àcids: Àcid Aspàrtic (Asp), Àcid glutàmic (Glu). Tenen un grup carboxil (-COO^-).

4. Aminoàcids polars amb càrrega possitiva, també es diuen aminoàcids clàssics: Són la Lysina (Lys), Histinina (His) i l´Arginina (Arg). La Lysina té un grup amil. La Histinina té un grup guanínic i l´Arginina té un anell d´imidazol.

El grup COO^- també té un Pk. El Pk_R de l´àcid Aspàrtic i Glutàmic és de 4´4. Els Pk dels grups COOH i els PK_R i els Ph de la Cysteïna, Tyroxina, Lysina i Arginina són molt allunyats i gairebé sempre estan protonats. La histinina té un Pk molt proper al fisiològic i la histinina i les proteïnes que la tinguin poden actuar com a tampons i reguladors del Ph. Si el medi s´acidifica, els protons són capturats per la histinina i seran neutralitzats. També succeeix al revés perquè es dissocien.

La Cysteïna amb un grup -SH com a R, fa que quan es trobin 2 grups -SH i quan les condicions són favorables, es poden oxidar i formar un pont disulfur -S-S- i ajuden sobretot a mantenir l´estructura tridimensional que es fixen mitjançant la formació de ponts disulfurs a les proteïnes. També hi ha ponts disulfurs extracatenaris (entre diferents cadenes) o intracatenaris.

PROTEÏNES

Els aminoàcids es troben units a les proteïnes mitjançant enllaços peptídics. L´enllaç peptídic és un enllaç de tipus amida entre el grup a-carboxil d´un aminoàcid i el grup
a-amí d´altre grup aminoàcid.

Totes les proteïnes comencen pel grup amí lliure i acaben pel grup carboxil lliure.

L´enllaç peptídic té 3 característiques:

1. És rígid: és un enllaç senzill però no té lliure rotació perquè es poden escriure formes de ressonància diferents causats pels electrons dels carbonil que es troben al Carboni i nitrògen. Es pot escriure . Per això té característiques de doble enllaç i no té lliure rotació. Els enllaços senzills són enllaços amb d1stància llarga, 1´5 Armstrongs. Els dobles enllaços estan més propers, 1´24 Armstrongs. L´enllaç peptídic té una distància d´1´32 Armstrongs i no és ni d´un tipus ni de l´altre.

2. És planar: els 4 àtoms implicats a l´enllaç peptídic es troben al mateix pla.

3. És un enllaç trans: Com l´enllaç és semblant al doble enllaç, té l´oxígen cap a un costat i l´Hidrògen cap a l´altre.

L´estructura de les proteïnes té 4 categories:

· L´estructura primària de les proteïnes és la seqüència ordenada d´aminoàcids d´una proteïna mitjançant l´enllaç peptídic.

· L´estructura secundària es refereix al replegament tridimensional d´aquesta seqüència a l´espai. És un plegament fixe. Hi ha 3 tipus: Hèlix a, fulla plegada b i gir b. A l´hèlix a, la cadena peptídica forma una hèlix levògira. Sempre té les mateixes dimensions. 2 aminoàcids contigus estan separats sempre mitjançant 100º i 1´5 Armstrongs. Cada volta té 3´6 aminoàcids. Sempre l´esquelet de l´hèlix està format per l´esquelet de la cadena peptídica i els grups Radicals per fora. Això permet que l´estructura sigui molt estable perquè permet que s´estableixin múltiples interaccions de tipus pont d´hidrògen entre els Oxígens d´un carboxil i el grup amí que és de l´aminoàcid situat a sota (4 aminoàcids més separats a la seqüència). Tots els grups carbonils i els grups amí estan formant ponts d´hidrògen d´aquesta manera. L´estructura tridimensional que adopta una proteïna ve marcada per la termodinàmica. El contingut de l´hèlix a de les proteïnes és molt variable. Les queratines són totes estructures hèlix a, i hi ha altres en que no hi ha res en hèlix a. L´hemoglobina té el 70% en hèlix a. A la fulla plegada b participen varis fragments de la seqüència que es situen de forma paral·lela a l´espai. L´esquelet de les làmines és l´esquelet de la seqüència peptídica. Els grups radicals quden situats cap a l´exterior de la fulla. Està estabilitzada per ponts d´Hidrògen que es formen entre el grup carboxílic i el grup amí (tots formen ponts d´Hidrògen), per això, és molt estable. Els radicals són elements distorsionants de l´estructura. Hi ha 2 tipus de fulles plegades (antiparal·leles o paral·leles, depenent del sentit en el que corren les cadenes que formen la fulla. La fulla plegada b és una estructura molt més oberta i extensa que l´hèlix a. Els aminoàcids estan separats 3´5 Armstrongs. Hi ha proteïnes amb molta estructura en b (b-queratina, 100%). El gir b és el gir que la cadena peptídica adopta. Està estabilitzat per ponts d´Hidrògen entre l´aminoàcid 1 i l´aminoàcid 4. La triple hèlix del colàgen és una estructura molt ben definida que es troba al colàgen. L´hemoglobina té 5 hèlix a que sempre es pleguen iguals i una part hemo. La ribonucleasa té zones amb hèlix a i zones amb fulla b. A més té ponts disulfur.

· L´estructura terciària de les proteïnes és la conformació tridimensiona de la proteïna. És el plegament total de la proteïna.

· L´estructura quaternària es dóna només a proteïnes oligomèriques (que tenen vàries subunitats), a diferència de les proteïnes monomèriques que només tenen una subunitat. Aquestes subunitats estan interaccionant amb forces no covalents. Hi ha alguns casos en el que poden haver ponts disulfurs unint les subunitats i aquestes interaccions modifiquen el comportament de les proteïnes.

· L´estructura supersecundària es dón a regions de la proteïna que es pleguen amb una secundària definida i contigües a altres estructures secundàries.

El domini són zones, regions o fragments que tenen un plegament determinat. P. Ex: anticossos. Les cadenes pesades de les immunoglobulines estan organitzades en 4 dominis diferents. Són interessants perquè tenen implicacions de tipus evolutiu i genètic.

Desde l´evolució es pensen que moltes proteïnes s´han diversificat perquè un exó s´ha multiplicat i ha donat diferents proteïnes. Si hi ha 2 exons iguals (duplicats), s´ha pogut mutar un exó i donar una evolució a tota la proteïna.

Les proteïnes es pleguen d´una manera determinada perquè només hi ha un plegament possible per a una cadena peptídica i serà el més estable possible termodinàmicament. La informació sobre com s´ha de plegar una proteïna està continguda dins de la seva seqüència de DNA.

La ribonucleasa (trenca les cadenes de DNA) té 4 ponts disulfurs. Es vol desnaturalitzar i desmuntar els seus ponts disulfurs. S´utilitza b-menaptoetanol. També s´utilitzen reactius caotròpics (molècules molt petites i polars que competeixen amb els aminoàcids per formar ponts. Normalment l´urea augmenta molt la seva concentració. La diàlisi consisteix en que s´administra l´urea i b-menaptoetanol amb un plàstic amb un por determinat. Si es col·loquen a un vas de precipitat amb H₂O o un tampó, farà que l´urea i el b-menaptoetanol sortin fins a equilibrar les concentracions a dins i fora. Si es fa varis cops, s´eliminina tota la urea i el b-menaptoetanol. Aquesta ribonucleasa es tornarà a plegar bé de manera espontània i tornarà a ser activa. Aquest experiment va demostrar que l´adquisició del plegament d´una cadena peptídica és espontani. Si abans de que es plegui del tot hi afegim un reactiu determinat, farà que es formin els ponts disulfurs entre les parts errònies. Si primer s´oxida i després es fa la diàlisi, no es forma de nou correctament la proteïna. Si l´afegim b-menaptoetanol, es tornarà a plegar correctament la proteïna.

Es treu com a conclussió que el plegament d´una proteïna ventral determinat per la seva seqüència d´aminoàcids. No totes les proteïnes es pleguen espontàniament. Aquesta ajuda ve donada per les chaperones. Quan hi ha el ribosoma amb la proteïna que s´està sintetitzant i l´ajuda a plegar-se de forma correcta.

En teoria, a les proteïnes s´hauria de poder predir el seu plegament, però a la pràctica no es pot predir. Ramachandra va elaborar diagrames on s´intenta establir quines conformacions són específiques per una cadena peptídica.

L´enllaç peptídic és rígid i l´enllaç de les cadenes peptídiques són fixes, en canvi la resta són variables. Ramachandra va dir que l´enllaç C-C era y (psi) i l´enllaç N-C_a era f (fi). Representa tots els valors de y i f possibles. Hi ha moltes conformacions possibles. Les àrees verdes sí que existeixen i s´han trobat. Les àrees grogues podrien existir però no s´han trobat.

Determinació de l´estructura primària d´una proteïna

Primer s´ha de purificar la proteïna perquè moltes proteïnes són minoritàries. És molt difícil. Es necessita molt poca quantitat. S´utilitza com a mètode la degradació d´Edman. Es fa mitjançant un procés molt senzill. Es marca el primer aminoàcid i s´identifica i elimina el primer aminoàcid modificat. Després es fa amb el segon aminoàcid.

El fenilisotiocionat és el reactiu que s´enganxa, uneix i trenca el primer aminoàcid. L´estructura del reactiu canvia i el primer aminoàcid és el PTH-aminoàcid. Això es fa successives vegades però no es pot fer més de 20 a 50 aminoàcids. Quan la proteïna és més gran es trenca en pèptids i es sintetitzen els pèptids. Els mètodes per fer això són:

· Reactius químics-> Bromur de cianògen (BrCN), que hidrolitza químicament l´enllaç peptídic del costat carboxílic d´una metilalanina. Aquests pèptids es separen mitjançant HPLC.

· Reactius enzimàtics-> L´ordre és mitjançant 2 degradacions proteolítiques, entre els protèctics s´utilitzen enzims digestius com la tripsina (que trenca els enllaços peptídics pels grups carboxi de Lys o Arg. Es separen i seqüencien i les proteïnes es junten) o la quimiotripsina.

COM SEQÜENCIAR UNA PROTEÏNA GRAN

Per seqüenciar una proteïna gran es trenca en pèptids petits mitjançant enzims que trenquin els enllaços peptídics específics. Un d´aquests reactius és BrCN, que trenca per darrera la metionina.

Els pèptids s´han de separar mitjançant cromatografía HPLC. Tenim 3 seqüències però no sabem quin és l´ordre dels pèptids. La solució és preparar un altre joc de pèptids que es trenquin per altres llocs (tryp: trenca per arginines o lisines) i ens dóna altres pèptids.

Si juguem amb la seqüència de pèptids i les solapem es pot saber fàcilment la seqüència d´aminoàcids.

Actualizado el Viernes, 12 Julio, 2002 19:43

Inicio.

VETERINARIOS@OLE.COM